En 2015 un articles parus dans nature médecine démontre que les scientifiques ont fabriqué des Corona virus particulièrement pathogènes dans leur laboratoire.

Utilisation du système de génétique inverse SARS-CoV 2, nous avons généré et caractérisé un virus chimérique exprimant le pic du coronavirus de chauve-souris SHC014 dans un squelette SARS-CoV adapté à la souris. Les résultats indiquent que les virus du groupe 2b codant pour la pointe SHC014 dans un squelette de type sauvage peuvent utiliser efficacement plusieurs orthologues de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine II (ACE2), se répliquer efficacement dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et atteindre des titres in vitro équivalents à une épidémie souches de SARS-CoV.


Un groupe de coronavirus de chauves-souris en circulation ressemblant au SRAS montre un potentiel d’émergence humaine

Médecine de la nature le volume 21 , pages1508 – 1513 ( 2015 ) Citer cet article

Abstrait

L’émergence du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) -CoV souligne la menace d’événements de transmission inter-espèces conduisant à des épidémies chez l’homme. Ici, nous examinons le potentiel de maladie d’un virus de type SRAS, SHC014-CoV, qui circule actuellement dans les populations de chauves-souris chinoises en fer à cheval 1 . Utilisation du système de génétique inverse SARS-CoV 2, nous avons généré et caractérisé un virus chimérique exprimant le pic du coronavirus de chauve-souris SHC014 dans un squelette SARS-CoV adapté à la souris. Les résultats indiquent que les virus du groupe 2b codant pour la pointe SHC014 dans un squelette de type sauvage peuvent utiliser efficacement plusieurs orthologues de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine II (ACE2), se répliquer efficacement dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et atteindre des titres in vitro équivalents à une épidémie souches de SARS-CoV. De plus, in vivoles expériences démontrent la réplication du virus chimérique dans le poumon de souris avec une pathogenèse notable. L’évaluation des modalités immunothérapeutiques et prophylactiques basées sur le SRAS a révélé une faible efficacité; les approches à base d’anticorps monoclonaux et de vaccins n’ont pas réussi à neutraliser et à protéger contre l’infection par les CoV en utilisant la nouvelle protéine de pointe. Sur la base de ces résultats, nous avons dérivé synthétiquement un virus recombinant SHC014 infectieux de pleine longueur et démontrons une réplication virale robuste à la fois in vitro et in vivo . Nos travaux suggèrent un risque potentiel de réémergence du SRAS-CoV à partir de virus circulant actuellement dans les populations de chauves-souris.Télécharger le PDF

Principale

L’émergence du SRAS-CoV a inauguré une nouvelle ère dans la transmission inter-espèces des maladies respiratoires graves, la mondialisation entraînant une propagation rapide dans le monde et un impact économique massif 3 , 4 . Depuis lors, plusieurs souches – dont les souches de grippe A H5N1, H1N1 et H7N9 et MERS-CoV – ont émergé des populations animales, causant des maladies, une mortalité et des difficultés économiques considérables pour les régions touchées 5 . Bien que des mesures de santé publique aient pu arrêter l’épidémie de SRAS-CoV 4 , des études récentes de métagénomique ont identifié des séquences de virus de type SRAS étroitement apparentés circulant dans les populations de chauves-souris chinoises qui pourraient constituer une menace future 1 , 6.. Cependant, les données de séquence à elles seules fournissent un minimum d’informations pour identifier et préparer les futurs virus prépandémiques. Par conséquent, pour examiner le potentiel d’émergence (c’est-à-dire le potentiel d’infecter les humains) des CoV des chauves-souris en circulation, nous avons construit un virus chimérique codant pour une nouvelle protéine de pointe Cooon zoonotique – à partir de la séquence RsSHC014-CoV qui a été isolée des chauves-souris chinoises en fer à cheval 1 —Dans le contexte du squelette adapté à la souris SARS-CoV. Le virus hybride nous a permis d’évaluer la capacité de la nouvelle protéine de pointe à provoquer une maladie indépendamment des autres mutations adaptatives nécessaires dans son squelette naturel. En utilisant cette approche, nous avons caractérisé l’infection au CoV médiée par la protéine de pointe SHC014 dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et in vivoet testé l’efficacité des immunothérapies disponibles contre SHC014-CoV. Ensemble, la stratégie traduit les données de métagénomique pour aider à prévoir et à préparer les futurs virus émergents.

Les séquences de SHC014 et du RsWIV1-CoV apparenté montrent que ces CoV sont les plus proches parents des souches épidémiques du SRAS-CoV ( Fig. 1a, b ); cependant, il existe des différences importantes dans les 14 résidus qui se lient, le récepteur de l’ ECA2 humain pour le SARS-CoV, y compris les cinq qui sont critiques pour la gamme d’hôtes: Y442, L472, N479, T487 et Y491 (réf. 7 ). Dans WIV1, trois de ces résidus diffèrent de la souche épidémique SARS-CoV Urbani, mais on ne s’attendait pas à ce qu’ils altèrent la liaison à ACE2 ( Fig. 1a, b et Tableau 1 ). Ce fait est confirmé par les deux expériences de pseudotypage qui ont mesuré la capacité des lentivirus codant pour les protéines de pointe WIV1 à pénétrer dans les cellules exprimant l’ACE2 humaine ( Fig. 1 supplémentaire) et par des essais de réplication in vitro de WIV1-CoV (réf. 1 ). En revanche, 7 des 14 résidus d’interaction ACE2 dans SHC014 sont différents de ceux dans SARS-CoV, y compris les cinq résidus critiques pour la gamme d’hôtes ( figure supplémentaire 1c et tableau supplémentaire 1 ). Ces changements, couplés à l’échec des lentivirus pseudotypés exprimant la pointe SHC014 à entrer dans les cellules ( figure supplémentaire 1d ), suggèrent que la pointe SHC014 est incapable de se lier à l’ACE2 humain. Cependant, des changements similaires dans les souches apparentées du SRAS-CoV ont été signalés pour permettre la liaison de l’ACE2 7 , 8, suggérant que des tests fonctionnels supplémentaires étaient nécessaires pour la vérification. Par conséquent, nous avons synthétisé le pic SHC014 dans le contexte du squelette SARS-CoV adapté à la réplication (nous désignons ci-après le CoV chimérique SHC014-MA15) pour maximiser la possibilité d’études de pathogenèse et de vaccins chez la souris ( Fig supplémentaire . 2a ). Malgré les prédictions des expériences de modélisation et de pseudotypage basées sur la structure, SHC014-MA15 était viable et répliqué à des titres élevés dans les cellules Vero ( figure supplémentaire 2b ). De façon similaire au SRAS, SHC014-MA15 nécessitait également une molécule ACE2 fonctionnelle pour l’entrée et pouvait utiliser des orthologues ACE2 humains, civettes et chauves-souris ( figure supplémentaire 2c, d). Pour tester la capacité de la pointe SHC014 à médier l’infection des voies respiratoires humaines, nous avons examiné la sensibilité de la lignée cellulaire des voies respiratoires épithéliales humaines Calu-3 2B4 (réf. 9 ) à l’infection et trouvé une réplication SHC014-MA15 robuste, comparable à celle de SARS-CoV Urbani ( figure 1c ). Pour étendre ces résultats, les cultures primaires d’épithélium des voies respiratoires humaines (AOH) ont été infectées et ont montré une réplication robuste des deux virus ( Fig. 1d ). Ensemble, les données confirment la capacité des virus avec la pointe SHC014 à infecter les cellules des voies respiratoires humaines et soulignent la menace potentielle de transmission inter-espèces de SHC014-CoV.

Figure 1
Figure 1: Les virus de type SRAS se répliquent dans les cellules des voies respiratoires humaines et produisent une pathogenèse in vivo .

Pour évaluer le rôle du pic SHC014 dans la médiation de l’infection in vivo , nous avons infecté des souris BALB / c âgées de 10 semaines avec 10 4 unités formant des plaques (pfu) de SARS-MA15 ou SHC014-MA15 ( Fig. 1e – h ). Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont connu une perte de poids rapide et une létalité 4 jours après l’infection (dpi); en revanche, l’infection par SHC014-MA15 a entraîné une perte de poids substantielle (10%) mais aucune létalité chez la souris ( figure 1e ). L’examen de la réplication virale a révélé des titres viraux presque équivalents dans les poumons de souris infectées par le SRAS-MA15 ou SHC014-MA15 ( figure 1f ). Alors que les poumons des souris infectées par le SRAS-MA15 présentaient une coloration robuste à la fois dans les bronchioles terminales et dans le parenchyme pulmonaire 2 dpi ( Fig. 1g), celles des souris infectées par SHC014-MA15 ont montré une diminution de la coloration de l’antigène des voies respiratoires ( Fig. 1h ); en revanche, aucun déficit de coloration antigénique n’a été observé dans le parenchyme ou dans le score histologique global, suggérant une infection différentielle du tissu pulmonaire pour SHC014-MA15 ( Tableau supplémentaire 2 ). Nous avons ensuite analysé l’infection chez des animaux âgés (12 mois) plus sensibles. Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont rapidement perdu du poids et succombé à l’infection ( figure supplémentaire 3a, b ). L’infection à SHC014-MA15 a induit une perte de poids robuste et soutenue, mais avait une létalité minimale. Les tendances de l’histologie et des profils de coloration de l’antigène que nous avons observées chez les jeunes souris ont été conservées chez les animaux plus âgés ( Tableau supplémentaire 3). Nous avons exclu la possibilité que SHC014-MA15 soit médiatrice de l’infection par un récepteur alternatif sur la base d’expériences utilisant des souris Ace2 – / – , qui n’ont pas montré de perte de poids ou de coloration d’antigène après une infection par SHC014-MA15 (Fig.4a , b et Supplémentaire supplémentaires Tableau 2 ). Ensemble, les données indiquent que les virus avec la pointe SHC014 sont capables d’induire une perte de poids chez la souris dans le contexte d’un squelette CoV virulent.

Compte tenu de l’efficacité préclinique des thérapies par anticorps monoclonaux contre Ebola, telles que ZMApp 10 , nous avons ensuite cherché à déterminer l’efficacité des anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV contre l’infection par SHC014-MA15. Quatre anticorps monoclonaux humains largement neutralisants ciblant la protéine de pointe du SRAS-CoV avaient déjà été signalés et sont des réactifs probables pour l’immunothérapie 11 , 12 , 13 . Nous avons examiné l’effet de ces anticorps sur la réplication virale (exprimé en pourcentage d’inhibition de la réplication virale) et avons constaté que, alors que le SARS-CoV de type sauvage Urbani était fortement neutralisé par les quatre anticorps à des concentrations d’anticorps relativement faibles ( Fig. 2a – d), la neutralisation variait pour SHC014-MA15. Le Fm6, un anticorps généré par l’affichage des phages et les mutants d’échappement 11 , 12 , n’a atteint que des niveaux de fond d’inhibition de la réplication SHC014-MA15 ( figure 2a ). De même, les anticorps 230.15 et 227.14, qui étaient dérivés de cellules mémoire B de patients infectés par le SRAS-CoV 13 , n’ont pas non plus bloqué la réplication de SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c). Pour les trois anticorps, les différences entre les séquences d’acides aminés des pics SARS et SHC014 correspondaient à des changements de résidus directs ou adjacents trouvés dans les mutants d’échappement SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E), ce qui explique probablement l’absence des anticorps ‘activité neutralisante contre SHC014. Enfin, l’anticorps monoclonal 109.8 a pu atteindre une neutralisation à 50% de SHC014-MA15, mais uniquement à des concentrations élevées (10 μg / ml) ( figure 2d ). Ensemble, les résultats démontrent que des anticorps neutralisants à grande échelle contre le SRAS-CoV ne peuvent avoir qu’une efficacité marginale contre les souches émergentes de CoV de type SRAS telles que SHC014.

Figure 2
Figure 2: Les anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV ont une efficacité marginale contre les CoV de type SRAS.

Pour évaluer l’efficacité des vaccins existants contre l’infection par SHC014-MA15, nous avons vacciné des souris âgées avec du SARS-CoV (DIV) entier double-inactivé. Des travaux antérieurs ont montré que DIV pouvait neutraliser et protéger les jeunes souris contre la provocation par un virus homologue 14 ; cependant, le vaccin n’a pas réussi à protéger les animaux âgés chez lesquels une pathologie immunitaire augmentée a également été observée, indiquant la possibilité que les animaux soient blessés en raison de la vaccination 15 . Ici, nous avons constaté que DIV n’a pas fourni de protection contre la provocation avec SHC014-MA15 en ce qui concerne la perte de poids ou le titre viral ( Fig. Supplémentaire 5a, b ). Conformément à un rapport précédent avec d’autres CoV hétérologues du groupe 2b 15, le sérum de souris âgées vaccinées par DIV n’a pas non plus neutralisé SHC014-MA15 ( figure supplémentaire 5c ). Notamment, la vaccination DIV a entraîné une pathologie immunitaire robuste ( tableau supplémentaire 4 ) et une éosinophilie ( figure supplémentaire 5d – f ). Ensemble, ces résultats confirment que le vaccin DIV ne protégerait pas contre l’infection par SHC014 et pourrait éventuellement augmenter la maladie dans le groupe vacciné âgé.

Contrairement à la vaccination des souris avec DIV, l’utilisation de SHC014-MA15 en tant que vaccin vivant atténué a montré une protection croisée potentielle contre la provocation par le SRAS-CoV, mais les résultats comportent d’importantes réserves. Nous avons infecté de jeunes souris avec 10 4 pfu de SHC014-MA15 et les avons observées pendant 28 jours. Nous avons ensuite provoqué les souris avec SARS-MA15 au jour 29 ( Fig. Supplémentaire 6a ). L’infection antérieure des souris par la forte dose de SHC014-MA15 a conféré une protection contre la provocation par une dose létale de SRAS-MA15, bien qu’il n’y ait eu qu’une réponse de neutralisation minimale du SRAS-CoV des antisérums déclenchée 28 jours après l’infection par SHC014-MA15 ( Fig.6b supplémentaire, 1: 200). En l’absence d’un boost d’antigène secondaire, 28 dpi représente le pic attendu de titres d’anticorps et implique qu’il y aura une protection diminuée contre le SRAS-CoV au cours du temps 16 , 17 . Des résultats similaires montrant une protection contre la provocation avec une dose létale de SARS-CoV ont été observés chez des souris BALB / c âgées en ce qui concerne la perte de poids et la réplication virale ( figure supplémentaire 6c, d ). Cependant, la dose d’infection SHC014-MA15 de 10 4 pfu a induit> 10% de perte de poids et de létalité chez certains animaux âgés ( Fig.1 et Fig.3 supplémentaire). Nous avons constaté que la vaccination avec une dose plus faible de SHC014-MA15 (100 pfu), n’induisait pas de perte de poids, mais elle ne protégeait pas non plus les animaux âgés d’une provocation par la dose létale du SRAS-MA15 ( figure supplémentaire 6e, f ). Ensemble, les données suggèrent que la provocation par SHC014-MA15 peut conférer une protection croisée contre le SRAS-CoV par le biais d’épitopes conservés, mais la dose requise induit la pathogenèse et empêche l’utilisation comme vaccin atténué.

Après avoir établi que la pointe SHC014 a la capacité de médier l’infection des cellules humaines et de provoquer des maladies chez la souris, nous avons ensuite synthétisé un clone infectieux SHC014-CoV de pleine longueur basé sur l’approche utilisée pour le SRAS-CoV ( Fig.3a ) 2 . La réplication dans les cellules Vero n’a révélé aucun déficit pour SHC014-CoV par rapport à celui pour SARS-CoV ( Fig. 3b ); cependant, SHC014-CoV a été significativement ( P <0,01) atténué dans les cultures primaires d’AOH à la fois 24 et 48 h après l’infection ( Fig. 3c ). L’ infection in vivo de souris n’a montré aucune perte de poids significative mais a montré une réplication virale réduite dans les poumons de l’infection SHC014-CoV complète, par rapport au SARS-CoV Urbani ( Fig. 3d, e). Ensemble, les résultats établissent la viabilité du SHC014-CoV de pleine longueur, mais suggèrent qu’une adaptation supplémentaire est nécessaire pour que sa réplication soit équivalente à celle du SARS-CoV épidémique dans les cellules respiratoires humaines et chez la souris.

figure 3
Figure 3: SHC014-CoV pleine longueur se réplique dans les voies respiratoires humaines mais n’a pas la virulence du SRV-CoV épidémique.

Pendant l’épidémie de SRAS-CoV, des liens ont été rapidement établis entre les civettes de palmier et les souches de CoV détectées chez l’homme 4 . Fort de ce constat, le paradigme de l’ émergence commune soutient que l’ épidémie de SRAS-CoV origine un virus de la chauve – souris, a sauté à civettes et les changements incorporés dans le domaine de liaison au récepteur (RBD) pour améliorer la liaison à civette Ace2 (réf. 18 ). Une exposition ultérieure à des personnes sur les marchés d’animaux vivants a permis à l’infection humaine de souche civette, qui, à son tour, s’est adaptée pour devenir la souche épidémique ( Fig. 4a ). Cependant, l’analyse phylogénétique suggère que les premières souches humaines du SRAS semblent plus étroitement liées aux souches de chauves-souris qu’aux souches de civette 18. Par conséquent, un deuxième paradigme soutient que la transmission directe entre la chauve-souris et l’homme a déclenché l’émergence du SRAS-CoV et que les civettes de palmier ont servi d’hôte secondaire et de réservoir pour une infection continue ( figure 4b ) 19 . Pour les deux paradigmes, l’adaptation des pointes chez un hôte secondaire est considérée comme une nécessité, la plupart des mutations devant se produire dans le RBD, facilitant ainsi une infection améliorée. Les deux théories impliquent que les pools de CoV des chauves-souris sont limités et que les mutations de la gamme d’hôtes sont à la fois aléatoires et rares, ce qui réduit la probabilité de futurs événements d’émergence chez l’homme.

figure4
Figure 4: Paradigmes d’émergence pour les coronavirus.

Bien que notre étude n’invalide pas les autres voies d’émergence, elle plaide pour un troisième paradigme dans lequel les pools de CoV de chauves-souris en circulation maintiennent des protéines de pointe “ en équilibre ” qui sont capables d’infecter les humains sans mutation ni adaptation ( Fig.4c ). Cette hypothèse est illustrée par la capacité d’un virus chimérique contenant la pointe SHC014 dans un squelette SARS-CoV à provoquer une infection robuste dans les cultures des voies respiratoires humaines et chez les souris sans adaptation RBD. Couplé avec l’observation de squelettes CoV pathogènes identifiés précédemment 3 , 20, nos résultats suggèrent que les matériaux de départ requis pour les souches émergentes de type SRAS circulent actuellement dans les réservoirs d’animaux. Notamment, bien que le SHC014-CoV de pleine longueur nécessite probablement une adaptation supplémentaire du squelette pour médier la maladie humaine, les événements de recombinaison à haute fréquence documentés dans les familles de CoV soulignent la possibilité d’une émergence future et la nécessité d’une préparation supplémentaire.

À ce jour, les dépistages génomiques des populations animales ont été principalement utilisés pour identifier de nouveaux virus dans les foyers 21. L’approche ici étend ces ensembles de données pour examiner les questions d’émergence virale et d’efficacité thérapeutique. Nous considérons les virus avec le pic SHC014 comme une menace potentielle en raison de leur capacité à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines primaires, le meilleur modèle disponible pour les maladies humaines. De plus, la pathogenèse observée chez la souris indique une capacité des virus contenant SHC014 à provoquer des maladies dans les modèles mammifères, sans adaptation RBD. Notamment, le tropisme différentiel dans les poumons par rapport à celui avec le SRAS-MA15 et l’atténuation du SHC014-CoV de pleine longueur dans les cultures d’AOH par rapport au SARS-CoV Urbani suggèrent que des facteurs au-delà de la liaison ACE2, y compris la processivité des pointes, la biodisponibilité des récepteurs ou l’antagonisme des réponses immunitaires de l’hôte – peut contribuer à l’émergence. cependant, des tests supplémentaires sur des primates non humains sont nécessaires pour traduire ces résultats en potentiel pathogène chez l’homme. Surtout, l’échec des thérapies disponibles définit un besoin critique pour une étude plus approfondie et pour le développement de traitements. Grâce à ces connaissances, des programmes de surveillance, des réactifs de diagnostic et des traitements efficaces peuvent être produits qui protègent contre l’émergence de CoV spécifiques au groupe 2b, tels que SHC014, et ceux-ci peuvent être appliqués à d’autres branches de CoV qui maintiennent des pools hétérogènes similaires.

En plus d’offrir une préparation contre les futurs virus émergents, cette approche doit être envisagée dans le contexte de la pause imposée par le gouvernement américain sur les études de gain de fonction (GOF) 22 . Sur la base des modèles d’émergence précédents ( Fig. 4a, b ), la création de virus chimériques tels que SHC014-MA15 ne devrait pas augmenter la pathogénicité. Bien que le SHC014-MA15 soit atténué par rapport à son SARS-CoV adapté à la souris parentale, des études similaires examinant la pathogénicité des CoV avec le pic Urbani de type sauvage dans le squelette MA15 n’ont montré aucune perte de poids chez la souris et une réplication virale réduite 23 . Ainsi, par rapport au pic Urbani-CoV MA15, SHC014-MA15 montre un gain de pathogenèse ( Fig. 1). Sur la base de ces résultats, les comités d’examen scientifique peuvent juger les études similaires construisant des virus chimériques basés sur des souches en circulation trop risquées, car une pathogénicité accrue dans les modèles mammifères ne peut être exclue. Couplé aux restrictions sur les souches adaptées à la souris et au développement d’anticorps monoclonaux utilisant des mutants d’échappement, la recherche sur l’émergence de CoV et l’efficacité thérapeutique pourrait être sérieusement limitée à l’avenir. Ensemble, ces données et restrictions représentent un carrefour des préoccupations de recherche du GOF; le potentiel de préparation et d’atténuation des futures flambées doit être mis en balance avec le risque de création d’agents pathogènes plus dangereux. En élaborant des politiques pour aller de l’avant,

Dans l’ensemble, notre approche a utilisé des données de métagénomique pour identifier une menace potentielle posée par la chauve-souris circulante de type SRV CoC SHC014. En raison de la capacité des virus chimériques SHC014 à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines, à provoquer une pathogenèse in vivo et à échapper aux thérapies actuelles, il existe un besoin à la fois de surveillance et de thérapies améliorées contre les virus de type SRAS en circulation. Notre approche permet également de déverrouiller l’utilisation des données métagénomiques pour prédire l’émergence virale et appliquer ces connaissances dans la préparation du traitement des futures infections virales émergentes.

Les méthodes

Virus, cellules, infection in vitro et tests sur plaque.

Le SARS-CoV de type sauvage (Urbani), le SARS-CoV adapté aux souris (MA15) et les CoV chimériques de type SARS ont été cultivés sur des cellules Vero E6 (obtenues auprès de l’Institut de recherche médicale des États-Unis sur les maladies infectieuses), cultivées dans le Eagle’s modifié de Dulbecco. moyen (DMEM) (Gibco, CA) et 5% de sérum de clone fœtal (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) avec un antibiotique / antimycotique (Gibco, Carlsbad, CA). Des cellules DBT (laboratoire barique, source inconnue) exprimant des orthologues ACE2 ont été précédemment décrites pour l’homme et la civette; la séquence Ace2 de la chauve-souris était basée sur celle de Rhinolophus leschenaulti , et les cellules DBT exprimant la chauve-souris Ace2 ont été établies comme décrit précédemment 8. Les expériences de pseudotypage étaient similaires à celles utilisant un pseudovirus basé sur le VIH, préparé comme décrit précédemment 10 , et examiné sur des cellules HeLa (Wuhan Institute of Virology) qui exprimaient des orthologues ACE2 . Les cellules HeLa ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) (Gibco, CA) additionné de 10% de FCS (Gibco, CA) comme décrit précédemment 24 . Les courbes de croissance dans Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 et les cellules épithéliales des voies aériennes humaines primaires ont été réalisées comme décrit précédemment 8 , 25. Aucun des stocks de lignées cellulaires de travail n’a été authentifié ou testé pour les mycoplasmes récemment, bien que les stocks de semences d’origine utilisés pour créer les stocks de travail soient exempts de contamination. Les poumons humains pour les cultures d’AOH ont été acquis en vertu de protocoles approuvés par le Chapel Hill Institutional Review Board de l’Université de Caroline du Nord. Les cultures d’AOH représentent un épithélium des voies respiratoires humaines hautement différencié contenant des cellules épithéliales ciliées et non ciliées ainsi que des cellules caliciformes. Les cultures sont également cultivées sur une interface air-liquide pendant plusieurs semaines avant utilisation, comme décrit précédemment 26. En bref, les cellules ont été lavées avec du PBS et inoculées avec du virus ou simulées diluées dans du PBS pendant 40 min à 37 ° C. Après l’inoculation, les cellules ont été lavées trois fois et du milieu frais a été ajouté pour signifier le temps “0”. Trois réplicats biologiques ou plus ont été récoltés à chaque moment décrit. Aucun aveuglement n’a été utilisé dans les collections d’échantillons ni les échantillons ont été randomisés. Toute la culture du virus a été réalisée dans un laboratoire de niveau de biosécurité (BSL) 3 avec des ventilateurs redondants dans les armoires de biosécurité, comme décrit précédemment par notre groupe 2 . Tout le personnel portait des respirateurs à adduction d’air filtré (Breathe Easy, 3M) avec des combinaisons, des tabliers et des bottillons Tyvek et portait un double gant.

Regroupement de séquences et modélisation structurale.

Les séquences génomiques complètes et les séquences d’acides aminés des domaines S1 du pic de CoV représentatifs ont été téléchargées à partir de Genbank ou Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), alignées avec ClustalX et comparées phylogénétiquement en utilisant l’estimation de la probabilité maximale à l’aide de 100 bootstrap ou en en utilisant PhyML ( https://code.google.com/p/phyml/), respectivement. L’arbre a été généré en utilisant le maximum de vraisemblance avec le package PhyML. La barre d’échelle représente les substitutions de nucléotides. Seuls les nœuds avec un support d’amorçage supérieur à 70% sont étiquetés. L’arbre montre que les CoV sont divisés en trois groupes phylogénétiques distincts définis comme des α-CoV, des β-CoV et des γ-CoV. Les grappes de sous-groupes classiques sont marquées 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et 1a et 1b pour les α-CoV. Des modèles structurels ont été générés à l’aide de Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) pour générer des modèles d’homologie pour SHC014 et Rs3367 du SARS RBD en complexe avec ACE2 sur la base de la structure cristalline 2AJF (Protein Data Bank). Les modèles d’homologie ont été visualisés et manipulés dans MacPyMol (version 1.3).

Construction de virus chimériques de type SRAS.

Les virus de type sauvage et chimérique sont tous deux dérivés du SARS-CoV Urbani ou du clone infectieux (ic) adapté à la souris (SARS-CoV MA15) comme décrit précédemment 27 . Les plasmides contenant des séquences de pointes pour SHC014 ont été extraits par digestion de restriction et ligaturés dans les plasmides E et F du clone infectieux MA15. Le clone a été conçu et acheté auprès de Bio Basic sous la forme de six ADNc contigus en utilisant des séquences publiées flanquées de sites d’endonucléases de restriction de classe II uniques (Bgll). Par la suite, des plasmides contenant des fragments de génome de type sauvage, SARS-CoV et SHC014-CoV de type sauvage ont été amplifiés, excisés, ligaturés et purifiés. Les réactions de transcription in vitro ont ensuite été préformées pour synthétiser l’ARN génomique complet, qui a été transfecté dans les cellules Vero E6 comme décrit précédemment2 . Le milieu des cellules transfectées a été récolté et a servi de stock de semences pour les expériences ultérieures. Les virus chimériques et de pleine longueur ont été confirmés par analyse de séquence avant utilisation dans ces études. La construction synthétique du mutant chimérique et du SHC014-CoV pleine longueur a été approuvée par le comité de biosécurité institutionnelle de l’Université de Caroline du Nord et le comité de recherche préoccupante à double usage.

Déclaration d’éthique.

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations pour le soin et l’utilisation des animaux par l’Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH. Le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC, numéro de permis A-3410-01) a approuvé le protocole d’étude sur les animaux (IACUC # 13-033) utilisé dans ces études.

Souris et infection in vivo .

Des souris BALB / cAnNHsD âgées de 10 semaines et 12 mois ont été commandées auprès des Laboratoires Harlan. Les infections de souris ont été effectuées comme décrit précédemment 20. En bref, les animaux ont été amenés dans un laboratoire BSL3 et autorisés à s’acclimater pendant 1 semaine avant l’infection. Pour l’infection et la vaccination contre le virus vivant atténué, les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine et infectées par voie intranasale, en cas de provocation, avec 50 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou virus dilué avec trois ou quatre souris par point dans le temps, par groupe d’infection par dose comme décrit dans les légendes des figures. Pour les souris individuelles, les notations d’infection, notamment le fait de ne pas inhaler la totalité de la dose, le bouillonnement de l’inoculum par le nez ou l’infection par la bouche, peuvent avoir conduit à l’exclusion des données de la souris à la discrétion du chercheur; post-infection, aucun autre critère d’exclusion ou d’inclusion préétabli n’est défini. Aucun aveuglement n’a été utilisé dans les expériences animales et les animaux n’ont pas été randomisés. Pour la vaccination, les souris jeunes et âgées ont été vaccinées par injection de coussins plantaires avec un volume de 20 μl de 0,2 μg de vaccin SRAS-CoV double-inactivé avec de l’alun ou du faux PBS; les souris ont ensuite été boostées avec le même régime 22 jours plus tard et provoquées 21 jours par la suite. Pour tous les groupes, selon le protocole, les animaux ont été surveillés quotidiennement pour les signes cliniques de la maladie (courbure, fourrure ébouriffée et activité réduite) pendant la durée de l’expérience. La perte de poids a été surveillée quotidiennement pendant les 7 premiers jours, après quoi la surveillance du poids s’est poursuivie jusqu’à ce que les animaux retrouvent leur poids de départ initial ou affichent une prise de poids continue pendant 3 jours. Toutes les souris qui ont perdu plus de 20% de leur poids corporel de départ ont été nourries au sol et surveillées plusieurs fois par jour tant qu’elles étaient sous la limite de 20%. Les souris qui ont perdu plus de 30% de leur poids corporel de départ ont été immédiatement sacrifiées selon le protocole. Toute souris jugée moribonde ou peu susceptible de récupérer a également été sacrifiée sans cruauté à la discrétion du chercheur. L’euthanasie a été réalisée à l’aide d’une surdose d’isoflurane et la mort a été confirmée par luxation cervicale. Toutes les études sur la souris ont été réalisées à l’Université de Caroline du Nord (assurance du bien-être animal # A3410-01) en utilisant des protocoles approuvés par le Comité UNC Institutional Animal Care and Use (IACUC).

Analyse histologique.

Le poumon gauche a été retiré et immergé dans du formol tamponné à 10% (Fisher) sans gonflement pendant 1 semaine. Les tissus ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μm ont été préparées par le centre d’histopathologie UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Pour déterminer l’étendue de la coloration de l’antigène, les coupes ont été colorées pour l’antigène viral en utilisant un anticorps anti-nucléocapside polyclonal SARS-CoV disponible dans le commerce (Imgenex) et notées de manière aveugle par pour la coloration des voies respiratoires et du parenchyme comme décrit précédemment 20 . Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope Olympus BX41 avec une caméra Olympus DP71.

Essais de neutralisation de virus.

Des essais de titre de neutralisation de la réduction de la plaque ont été réalisés avec des anticorps précédemment caractérisés contre le SRAS-CoV, comme décrit précédemment 11 , 12 , 13 . En bref, les anticorps neutralisants ou le sérum ont été dilués en série en double et incubés avec 100 pfu des différentes souches infectieuses de SARS-CoV de clone pendant 1 h à 37 ° C. Le virus et les anticorps ont ensuite été ajoutés à une plaque à 6 puits avec 5 x 10 5 cellules Vero E6 / puits avec de multiples réplicats ( n≥ 2). Après une incubation d’une heure à 37 ° C, les cellules ont été recouvertes de 3 ml d’agarose à 0,8% dans le milieu. Les plaques ont été incubées pendant 2 jours à 37 ° C, colorées au rouge neutre pendant 3 h et les plaques ont été comptées. Le pourcentage de réduction de la plaque a été calculé comme (1 – (nombre de plaques avec anticorps / nombre de plaques sans anticorps)) × 100.

Analyses statistiques.

Toutes les expériences ont été menées en contrastant deux groupes expérimentaux (soit deux virus, soit des cohortes vaccinées et non vaccinées). Par conséquent, des différences significatives dans le titre viral et la notation histologique ont été déterminées par un test t de Student bilatéral à des moments individuels. Les données étaient normalement distribuées dans chaque groupe comparé et présentaient une variance similaire.

Biosécurité et biosécurité.

Les études signalées ont été lancées après l’approbation du protocole expérimental par le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université de Caroline du Nord (Titre du projet: Génération de clones infectieux de CoV de type SRAS de chauve-souris; ID de plan de sécurité de laboratoire: 20145741; annexe G ID: 12279). Ces études ont été lancées avant la pause du financement de la recherche sur le processus délibératif du gouvernement américain sur certaines recherches sur le gain de fonction impliquant les virus de la grippe, du MERS et du SRAS ( http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf ). Ce document a été examiné par l’agence de financement, le NIH. La poursuite de ces études a été demandée, ce qui a été approuvé par le NIH.

SARS-CoV est un agent sélectif. Tous les travaux pour ces études ont été effectués avec des procédures opérationnelles normalisées (SOP) et des conditions de sécurité approuvées pour le SRAS-CoV, le MERs-CoV et d’autres CoV connexes. Nos installations institutionnelles CoV BSL3 ont été conçues pour se conformer aux exigences de sécurité recommandées par les laboratoires de biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), le ministère américain de la Santé et des Services sociaux, le service de santé publique, les Centers for Disease Control (CDC). ) et le NIH. Les plans de sécurité des laboratoires ont été soumis au Département de la santé et de la sécurité environnementale (EHS) et le CDC, et l’installation a été approuvée. Un accès par carte électronique est requis pour entrer dans l’établissement. Tous les travailleurs ont été formés par EHS pour utiliser en toute sécurité des respirateurs à adduction d’air filtré (PAPR), et des habitudes de travail appropriées dans un établissement BSL3 et des plans de surveillance médicale active sont en place. Nos installations CoV BSL3 contiennent des ventilateurs redondants, l’alimentation de secours des ventilateurs et des armoires de sécurité biologique et des congélateurs, et nos installations peuvent accueillir des racks de souris SealSafe. Les matériaux classés comme agents BSL3 sont constitués de souches de précurseurs du SRAS-CoV, de bat CoV, de MERS-CoV et de mutants dérivés de ces agents pathogènes. Dans les installations BSL3, l’expérimentation de virus infectieux est effectuée dans une armoire de biosécurité certifiée de classe II (BSC). Tous les membres du personnel portent des gommages, des combinaisons et des tabliers Tyvek, des PAPR et des couvre-chaussures, et leurs mains sont à double gant. Les utilisateurs de BSL3 sont soumis à un plan de surveillance médicale contrôlé par la Clinique de santé au travail des employés de l’Université (UEOHC), qui comprend un examen physique annuel, vaccination annuelle contre la grippe et déclaration obligatoire de tout symptôme associé à une infection au CoV pendant les périodes de travail dans le BSL3. Tous les utilisateurs de BSL3 sont formés à la gestion de l’exposition et aux protocoles de déclaration, sont prêts à se mettre en quarantaine et ont été formés pour une livraison en toute sécurité à un service local de gestion des maladies infectieuses en cas d’urgence. Tous les événements d’exposition potentiels sont signalés et étudiés par l’EHS et l’UEOHC, avec des rapports déposés à la fois au CDC et au NIH.

Codes d’adhésion

Accessions

Banque de données sur les protéines

Changer l’historique

  • 30 mars 2020Note de la rédaction, mars 2020: nous savons que cet article sert de base à des théories non vérifiées selon lesquelles le nouveau coronavirus à l’origine de COVID-19 a été conçu. Rien ne prouve que cela soit vrai; les scientifiques pensent qu’un animal est la source la plus probable du coronavirus.
  • 20 novembre 2015Dans la version de cet article initialement publiée en ligne, les auteurs ont omis de mentionner une source de financement, le financement USAID-EPT-PREDICT d’EcoHealth Alliance, à Z.-LS L’erreur a été corrigée pour les versions imprimée, PDF et HTML de cet article .

Références

  1. 1Ge, XY et al. Isolement et caractérisation d’un coronavirus de type chauve-souris SRAS qui utilise le récepteur ACE2. Nature 503 , 535-538 (2013).CAS Article Google Scholar 
  2. 2Yount, B. et al. Génétique inverse avec un ADNc infectieux complet du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 , 12995–13000 (2003).CAS Article Google Scholar 
  3. 3Becker, MM et coll. Le coronavirus synthétique de type SRAS de chauve-souris recombinante est infectieux dans les cellules en culture et chez la souris. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 , 19944–19949 (2008).CAS Article Google Scholar 
  4. 4Peiris, JS, Guan, Y. & Yuen, KY Syndrome respiratoire aigu sévère. Nat. Med. 10 , S88 – S97 (2004).CAS Article Google Scholar 
  5. 5Al-Tawfiq, JA et al. Surveillance des virus respiratoires émergents. Lancet Infect. Dis. 14 , 992–1000 (2014).Article Google Scholar 
  6. 6Lui, B. et al. Identification de divers alphacoronavirus et caractérisation génomique d’un nouveau coronavirus de type syndrome respiratoire aigu sévère provenant de chauves-souris en Chine. J. Virol. 88 , 7070–7082 (2014).Article Google Scholar 
  7. 7Li, F. Reconnaissance des récepteurs et infections inter-espèces du coronavirus du SRAS. Antiviral Res. 100 , 246–254 (2013).CAS Article Google Scholar 
  8. 8Sheahan, T. et al. Mécanismes de l’expansion de la gamme d’hôtes du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère zoonotique dans l’épithélium des voies respiratoires humaines. J. Virol. 82 , 2274–2285 (2008).CAS Article Google Scholar 
  9. 9Yoshikawa, T. et al. Réponses immunitaires innées dynamiques des cellules épithéliales bronchiques humaines à une infection au coronavirus associée au syndrome respiratoire aigu sévère. PLoS ONE 5 , e8729 (2010).Article Google Scholar 
  10. dixQiu, X. et al. Réversion de la maladie avancée du virus Ebola chez les primates non humains avec ZMapp. Nature 514 , 47-53 (2014).CAS Article Google Scholar 
  11. 11Sui, J. et al. Élargissement de l’activité de neutralisation pour bloquer directement une voie d’évolution SARS-coronavirus dirigée par des anticorps dominante. PLoS Pathog. 4 , e1000197 (2008).Article Google Scholar 
  12. 12Sui, J. et al. Effets des anticorps humains du domaine de liaison aux récepteurs des protéines anti-pics sur le syndrome respiratoire aigu sévère, la neutralisation du coronavirus, la fuite et la forme physique. J. Virol. 88 , 13769-13780 (2014).Article Google Scholar 
  13. 13Rockx, B. et al. L’évasion de la neutralisation des anticorps monoclonaux humains affecte l’ aptitude in vitro et in vivo du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. J. Infect. Dis. 201 , 946–955 (2010).CAS Article Google Scholar 
  14. 14Spruth, M. et al. Un vaccin contre le coronavirus candidat au virus entier à double inactivation contre le SRAS stimule les réponses des anticorps neutralisants et protecteurs. Vaccine 24 , 652–661 (2006).CAS Article Google Scholar 
  15. 15Bolles, M. et al. Un vaccin contre le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère à double inactivation offre une protection incomplète chez la souris et induit une réponse pulmonaire pro-inflammatoire éosinophile accrue lors de la provocation. J. Virol. 85 , 12201–12215 (2011).CAS Article Google Scholar 
  16. 16Siegrist, C.-A. dans Vaccines 6th edn. (éd. Plotkin, SA, Orenstein, WA & Offit, PA) 14–32 (WB Saunders, 2013).
  17. 17Deming, D. et al. Efficacité vaccinale chez des souris sénescentes stimulées par des variantes d’épidémie et de spoon zoonotiques portant le SARS-CoV recombinant. PLoS Med. 3 , e525 (2006).Article Google Scholar 
  18. 18Graham, RL, Donaldson, EF & Baric, RS Une décennie après le SRAS: stratégies de contrôle des coronavirus émergents. Nat. Rev. Microbiol. 11 , 836–848 (2013).CAS Article Google Scholar 
  19. 19Graham, RL & Baric, RS Recombination, reservoirs and the modular spike: mécanismes of coronavirus cross-species transmission. J. Virol. 84 , 3134-3146 (2010).CAS Article Google Scholar 
  20. 20Agnihothram, S. et al. Un modèle de souris pour le sous-groupe 2c de bétacoronavirus utilisant une variante de la souche HKU5 de la souche de coronavirus de chauve-souris. MBio 5 , e00047-14 (2014).Article Google Scholar 
  21. 21Relman, DA Métagénomique, diagnostic des maladies infectieuses et enquêtes sur les flambées: séquence d’abord, poser des questions plus tard? Confiture. Med. Assoc. 309 , 1531-1532 (2013).CAS Article Google Scholar 
  22. 22Kaiser, J. Moratorium sur les études de virologie à risque laisse le travail dans 14 institutions dans les limbes. ScienceInsider http://news.sciencemag.org/biology/2014/11/moratorium-risky-virology-studies-leaves-work-14-institutions-limbo (2014).
  23. 23Frieman, M. et al. Déterminants moléculaires de la pathogenèse et de la virulence du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère dans des modèles de maladie humaine chez les souris jeunes et âgées. J. Virol. 86 , 884–897 (2012).CAS Article Google Scholar 
  24. 24Ren, W. et al. Différence d’utilisation des récepteurs entre le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et le coronavirus de type SRAS d’origine chauve-souris. J. Virol. 82 , 1899-1907 (2008).CAS Article Google Scholar 
  25. 25Sims, AC et al. La libération du bloc d’importation nucléaire du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère améliore la transcription de l’hôte dans les cellules pulmonaires humaines. J. Virol. 87 , 3885-3902 (2013).CAS Article Google Scholar 
  26. 26Fulcher, ML, Gabriel, S., Burns, KA, Yankaskas, JR & Randell, SH Cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires humaines bien différenciées. Méthodes Mol. Med. 107 , 183-206 (2005).CAS PubMed Google Scholar 
  27. 27Roberts, A. et al. Un coronavirus du SRAS adapté à la souris provoque la maladie et la mortalité chez les souris BALB / c. PLoS Pathog. 3 , e5.Article Google Scholar 

Télécharger les références

Remerciements

La recherche dans ce manuscrit a été financée par des subventions de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l’Institut national du vieillissement des National Institutes of Health des États-Unis (NIH) dans le cadre des prix U19AI109761 (RSB), U19AI107810 (RSB), AI085524 (WAM), F32AI102561 (VDM) et K99AG049092 (VDM), et par la National Natural Science Foundation of China attribue 81290341 (Z.-LS) et 31470260 (X.-YG), et par le financement USAID-EPT-PREDICT d’EcoHealth Alliance (Z. -LS). Les cultures épithéliales des voies respiratoires humaines ont été soutenues par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales du NIH sous le prix NIH DK065988 (SHR). Nous remercions également MT Ferris (Département de génétique, Université de Caroline du Nord) pour la revue des approches statistiques et CT Tseng (Département de microbiologie et immunologie, University of Texas Medical Branch) pour avoir fourni des cellules Calu-3. Des expériences avec les virus recombinants SHC014 pleine longueur et chimériques ont été lancées et réalisées avant la pause de financement de la recherche GOF et ont depuis été examinées et approuvées pour une étude continue par le NIH. Le contenu est sous la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH.

Informations sur l’auteur

Affiliations

  1. Département d’épidémiologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis
    • Vineet D Menachery
    • , Boyd L Yount Jr
    • , Kari Debbink
    • , Lisa E Gralinski
    • , Jessica A Plante
    • , Rachel L Graham
    • , Trevor Scobey
    • , Eric F Donaldson
    •  & Ralph S Baric
  2. Département de microbiologie et d’immunologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis
    • Kari Debbink
    •  & Ralph S Baric
  3. Centre national de recherche toxicologique, Food and Drug Administration, Jefferson, Arkansas, États-Unis
    • Sudhakar Agnihothram
  4. Laboratoire clé des agents pathogènes spéciaux et de la biosécurité, Institut de virologie de Wuhan, Académie chinoise des sciences, Wuhan, Chine
    • Xing-Yi Ge
    •  & Zhengli-Li Shi
  5. Département de biologie cellulaire et de physiologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis
    • Scott H Randell
  6. Kystic Fibrosis Center, Marsico Lung Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis
    • Scott H Randell
  7. Institut de recherche en biomédecine, Institut de microbiologie de Bellinzone, Zurich, Suisse
    • Antonio Lanzavecchia
  8. Department of Cancer Immunology and AIDS, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, États-Unis
    • Wayne A Marasco
  9. Département de médecine, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, États-Unis
    • Wayne A Marasco

Contributions

VDM a conçu, coordonné et réalisé des expériences, terminé l’analyse et rédigé le manuscrit. BLY a conçu le clone infectieux et récupéré les virus chimériques; SA a terminé les tests de neutralisation; LEG a aidé à réaliser des expériences sur la souris; TS et JAP ont terminé des expériences sur souris et des analyses de plaque; X.-YG a effectué des expériences de pseudotypage; KD a généré des chiffres structurels et des prévisions; Analyse phylogénétique générée par EFD; RLG a terminé l’analyse d’ARN; SHR a fourni des cultures primaires d’AOH; AL et WAM ont fourni des réactifs d’anticorps monoclonaux critiques; et Z.-LS ont fourni des séquences de pointes et des plasmides SHC014. RSB a conçu des expériences et écrit un manuscrit.

Auteurs correspondants

Correspondance avec Vineet D Menachery ou Ralph S Baric .

Déclarations éthiques

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent une absence d’intérêts financiers en compétition.

Information supplémentaire

Texte et figures supplémentaires

Figures supplémentaires 1 à 6 et tableaux supplémentaires 1 à 4 (PDF 4747 ko)

Source : https://www.nature.com/articles/nm.3985?fbcldi=lwAROiTTfDITuxNFPtvQHxFrF6QaF1hKE1Ey2TPrEi17XfFUIbpUIAosDc

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out /  Change )

Google photo

You are commenting using your Google account. Log Out /  Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out /  Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out /  Change )

Connecting to %s